全血樣本:一般來說,血液樣本必須在6個小時內處理,晚不得超過12小時;做完染色后,需要放在多聚甲醛中保存,一般可以存放3天左右。
培養細胞樣本:培養的細胞可以用多聚甲醛保存。做DNA倍體的樣本:將樣本保存在70%的乙醇中,并適量加入血清,-70℃冰箱保存,可以幾個月內檢測。
抗體染色的流式細胞不能立即檢測該如何處理?
如果實驗對細胞活性要求比較高,如凋亡實驗,必須盡快檢測;如果實驗對細胞活性要求不高,可以使用含有4%多聚甲醛的PBS固定樣本30分鐘,固定后的細胞4℃過夜保存,次日檢測。
同型對照的作用是什么?
抗體有時會和非抗原結合,可能會因為非特異的蛋白-蛋白相互作用結合細胞內成分,因為疏水作用結合脂肪,也可能會結合一些細胞表面表達的抗體受體。比如,IgG亞型的抗體會結合細胞表面的Fc受體,如CD16、CD32和CD64。理想條件下,各種類型的非特異性結合都可以通過蛋白(BSA、牛奶或動物血清)來阻斷。Fc受體的結合則可以通過與含免疫球蛋白的血清預孵育來阻斷。一個抗體非特異性相互作用和受體結合的情況,可以用無關抗原的相同亞型抗體來比照。
什么時候需要使用同型對照?
做胞內流式實驗:比如流式細胞胞內細胞因子、趨化因子和信號蛋白等。
表面標志特異性不高或者不常見的: 一些特異性不高的抗體,如多抗,非特異性結合非常多,使用同型對照可排除假陽性; 因為不熟悉不常見標志的表達情況,根據同型對照可以判斷陽性細胞的位置,對流式非常熟悉,且檢測的是CD3、CD4、CD19等表達強度非常高的標志,可以不使用同型對照。
怎樣選擇同型對照?
一般選擇與一抗的成分相同種屬來源、相同亞型和亞鏈、相同熒光標記的抗體比如抗人的CD56 FITC標記的抗體,亞型是Mouse IgG1,κ,那么它的同型對照應該是FITC標記的Mouse IgG1,κ,如果是抗體的組合形式,純化的一抗+熒光標記的二抗,那么應該選擇一抗的同型對照比如CD86的純化抗體,亞型是Mouse IgG1,κ,二抗是PE標記的抗小鼠IgG1,那么它的同型對照是純化的Mouse IgG1,κ。染色方式如下:樣本管,純化的CD86+PE標記的抗Mouse IgG1(二抗)+樣本;同型對照管,純化的同型對照+PE標記的抗Mouse IgG1(二抗)+樣本。
如果沒有找到適合的同型對照,在保持來源相同、熒光標記相同、免疫球蛋白類別相同條件下,優先選擇的順序是亞鏈不同--亞型不同--相同類別比如,某抗體的來源是Mouse IgG2а,κ。如果在同型對照表里找不到相同的同型對照,那么優先選擇相同熒光標記Mouse IgG2а為同型對照;如果也沒有找到Mouse IgG2а,那么優先選擇相同熒光標記的Mouse IgG2b作為同型對照;如果后還是沒有找到Mouse IgG2b,那么選擇相同熒光標記的Mouse IgG2作為同型對照。
為什么有時候同型對照的表達會比抗體的表達高?
首先需要檢查同型對照是否加錯類型、劑量等。其次,因為有些標志在細胞的表面或者胞內表達不高,而跟其類似的抗原非常多,那么加入同型對照時,同型對照非特異性的結合會超過抗體的特異性,所以會造成這種現象。這個時候推薦使用其他陰性對照,如空白對照等。